全國博碩士研究報告

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◆牛樟菇子實體乙醇萃取物誘導 HL60 細胞凋亡之研究 教授 : 賴宏亮 研究生 : 呂美津 校院名稱 : 屏東科技大學 研究對象及範圍 : 牛樟菇 子實體乙醇萃取物誘導 HL60 細胞凋亡之研究 牛樟菇 (Antrodia camphorata) 又名樟菇、樟芝，屬擔子菌綱的藥用性真菌類，在台灣民間用於癌症治療，但是尚未有科學研究證實其抗癌作用。本研究提出 牛樟菇 抗癌的生物活性主要作用是誘導腫瘤細胞發生凋亡現象的假說，並由以下的實驗來證實。實驗設計中，以 trypan blue exclusion 、 Liu's stain 及 TUNEL (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) 染色等檢查法，直接利用顯微鏡觀察 牛樟菇 子實體之乙醇萃取物誘導人類白血病前骨髓細胞 (human promeylocytic leukemia cell) 發生細胞凋亡的現象。以 DNA agarose electrophoresis 來分析細胞凋亡後在膠體電泳呈現的 DNA 斷裂現象 (DNA ladder) ，所產生清晰 DNA ladder 的膠體電泳結果證實細胞凋亡所得到 DNA 片段約為 180bp 倍數的特定長度。並以流式細胞儀 (flow cytometry) 經 propidium iodide (PI) 及 Annexin- Ⅴ -FITC 雙重螢光染色後檢測凋亡細胞的比例。研究結果顯示，以 200 μg/ml 的 牛樟菇 萃取物處理 6 小時後，與對照組比較下，細胞凋亡的比例從少於 5% 增加至 36% ； 牛樟菇 乙醇萃取物處理 24 小時後，單染 PI 以流式細胞儀分析出凋亡細胞的比例從 5% 增加至 42% 。綜合以上的結果證實，以 200 μg/ml 的 牛樟菇 乙醇萃取物處理人類白血病前骨髓細胞，導致 HL60 細胞發生細胞凋亡的現象最為顯著。因此，本研究首度提出 牛樟菇 萃取物，確實可透過誘導人類白血病前骨髓細胞發生凋亡的現象而達到抗癌之作用。 ◆固態栽培 樟芝防治癌症之重要機轉 - 癌症逆轉 教授 : 鄧文炳 研究生 : 陳佳鈺 校院名稱 : 臺北醫學大學 研究對象及範圍 : 固態栽培 樟芝防治癌症之重要機轉 - 癌症逆轉 根據研究發現癌症是可以逆轉的，以感染病毒或以化學物質處理或與放射線接觸等方式藉著啟動腫瘤細胞中之逆轉作用機制，讓癌細胞不表現腫瘤特性，甚至於恢復成相當程度之正常細胞。所謂癌症逆轉現象 (Cancer Reversion) ，意指腫瘤細胞回復「部分正常」，而成為不具威脅性地可與人體共存的人癌共生現象。 本實驗室已經建立了可供癌症逆轉機制探討的研究模式。 樟 芝﹐又稱牛 樟 芝或牛 樟 菇，是台灣特有的真菌，因無法以人工栽培，因此更顯得珍貴。以其中的多醣體 (Polysccharides) 、三帖類 (Triterpenoids) 及超氧歧化酵素 (Superoxide Dismutase) 為主要的研究份。根據初步研究 樟 芝有明顯的抑制腫瘤細胞生長及抑制癌病毒作用的效果，且以 樟 芝進行細胞試驗，結果顯示 樟 芝具有癌症逆轉的特性。 具腫瘤誘發性的 HeLa 細胞的表面抗原，其具有自磷酸化 (Autophosphorylation) 活性，是一種細胞的腸鹼性磷酸酵素 (Intestinal alkaline phosphatase, IAP) ，因此本實驗室嘗試解析 IAP 表現與腫瘤誘發性之間的關係。實驗結果發現 樟 芝能夠抑制腫瘤細胞內鹼性磷酸酵素的表現。此外在基因層面的探討，初步實驗結果發現， 樟 芝有增強抑癌基因 p53 表現的趨勢；而對子宮頸癌主要的 E6/E7 致病因子則有抑制的功效。在動物實驗方面，餵食 樟 芝對於腫瘤細胞生長確實有抑制的效果。以流式細胞儀技術分析 樟 芝對癌細胞的影響，可能並非走細胞毒殺的路徑，因此可以更加的推斷藥物對細胞的作用是進行癌症逆轉的模式。 ◆樟芝菌絲體培養之胞外多醣體應用於抗老化化妝品成份之研究 教授 : 呂敏勇 研究生 : 鄭懿芳 校院名稱 : 嘉南藥理科技大學 研究對象及範圍 : 樟芝菌絲體培養之胞外多醣體應用於抗老化化妝品成份之研究 樟 芝 (Antrodia camphorata) 是台灣發現的特有物種，已知它是一種藥用菇類，廣泛應用於傳統中藥上。它的生理活性物質尚在分析中，目前已知主要的有效成分為多醣體及三 帖類。本研究的目的在探討以 樟 芝菌絲體深層培養所獲得的胞外多醣體，應用於抑制 3T3 纖維母細胞所分泌基質金屬蛋白 酶(matrix metalloproteinases, MMP) 的活性；經由 gelatin-based zymography 進行 MMP-2 及 MMP-9 的活性分析，我們發現 樟 芝胞外多醣體於 0.5 mg/ml 的處理劑量下，可以抑制 MMP-2 及 MMP-9 的活性，於 48 小時最為顯著。另一方面，利用不同的酒精濃度沉澱 樟 芝胞外多醣體，經由膠體過濾層析法 (gel permeation chromatography) 分析，證實不同的酒精濃度可分離得到不同分子量的多醣體；這些不同分子量的多醣體中，以 33% 酒精濃度沉澱分離的多醣體抑制 MMP-9 的活性最顯著，而 50~75% 沉澱酒精濃度所分離的多醣體抑制 MMP-2 活性的效果最佳。令人驚訝的是 50~75% 酒精濃度沉澱所得到的多醣體，於 0.5 mg/ml 的劑量，處理纖維母細胞 4~8 小時，在與控制組比較之下，發現膠原蛋白的累積量可增加 38% 。因此，我們認為 樟 芝胞外多醣體可應用於抗老化化妝品的成份。 ◆樟芝對倉鼠體內脂質代謝與抗氧化狀態之影響 教授 : 蔡敬民 研究生 : 劉翠玲 校院名稱 : 輔仁大學 研究對象及範圍 : 樟芝對倉鼠體內脂質代謝與抗氧化狀態之影響 樟 芝（ Antrodia camphorata ）屬於台灣特有真菌類，僅寄生於台灣特有品種牛 樟 樹之樹洞中，民間認為其具有許多保健功效。然而子實體栽培困難，故近年多以深層發酵之人工培育方法來生產，但是否仍具生理功能則須以科學方法加以探討。本研究目的乃探討高血脂倉鼠攝取經深層發酵所得 樟 芝菌絲體或發酵液，對體內脂質代謝與抗氧化狀態的影響。實驗以雄性倉鼠 48 隻分為 6 組，分別餵予含 15% 油脂與 0.2% 膽固醇的高脂飲食，另每日管餵 0.01g 之蒸餾水（控制組）、 樟 芝 An5 培養液、 An5 發酵液、 樟 芝 GK101 培養液、 GK101 發酵液或 GK101 菌絲體，飼養 4 週後，犧牲取得血液與肝臟進行生化分析。結果顯示， An5 發酵液和 GK101 菌絲體均可顯著降低血清與肝臟中三酸甘油酯（ TG ）濃度，而二種發酵液都能降低血清與肝臟中總膽固醇濃度（ TC ）。另 GK101 發酵液和菌絲體均可降低血清低密度脂蛋白膽固醇（ LDL-C ）濃度，但各種發酵液或菌絲體均對血清高密度脂蛋白膽固醇（ HDL-C ）濃度沒有影響。抗氧化方面，發酵液與菌絲體均可顯著提升血清總抗氧化狀態， An5 發酵液與 GK101 菌絲體可延長 2,2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride （ AAPH ）誘導紅血球溶血時間；二種發酵液可增加 LDL 之氧化遲滯期。對於抗氧化酵素而言，發酵液與菌絲體均可顯著提升肝臟中麩胱甘  過氧化物（ GSH-Px ）活性， An5 發酵液另可提升葡萄糖 -6- 磷酸去氫 酶 （ G-6-PDH ）和超氧歧化 酶 （ SOD ）等酵素活性。由結果可知， 樟芝菌絲體和發酵液對於高油脂飲食所誘發的高脂血症與氧化壓力具有保護功能，深具開發成保健食品的潛力。 ◆肝癌 VS 牛樟芝一 教授 : 朱延和 ; 陳水田 研究生 : 陳伯珠 校院名稱 : 國立中山大學 研究對象及範圍 : 高通量篩選出牛樟芝菌絲體抗肝癌先導藥物化合物二 . 以 p53 、 bax 、 bcl-2 之 m-RNA 層次進行抗肝癌先導藥物化合物對人類肝癌細胞株 摘要 ： Antrodia camphorata 俗名牛樟芝，是在台灣發現特有的真菌類品種，它的子實體已被當作中草藥使用在各種不同的疾病的治療中。 最近的在體內實驗 (in vivo) 研究中已經顯示牛樟芝的粗萃取物能改善肝臟功能，增加免疫而且抑制癌的生長。 本研究的目地是由牛樟芝的菌絲體對人類的肝癌細胞上的藥物作用識定出生物活性化合物。 我們藉由使用人類的肝癌症細胞株進行高通量篩選分析及搜尋粗萃物的生物活性物質，而不是使用費時和昂貴的動物實驗。 起先，我們很高興發現，當牛樟芝的菌絲體和子實體的粗萃物處理於人類的肝癌細胞株 Hep 3B 48 小時，獲得 IC50 分別為 44.25 和 12.22 μg/mL 。 牛樟芝的菌絲體粗萃物進一步放入矽膠管柱中進行分離，將之分開成十二部份後再分別處理於人類的肝癌細胞株 Hep 3B ，我們發現顯著的生物活性在第六部份 (F6) 其 IC50 為 6.4614 μg/mL ，之後我們使用 HPLC 和 TLC 來純化出 F6 活性的成分和使用 MS 和 NMR 及 IR 來進行化學結構識定。 此化合物被鑑定為 1-hydroxy -3-isobutyl -4- [4-(3-methyl-but-2-enyloxy)-phenyl]-pyrrole-2,5-dione （分子式： C19H23NO4 ; 分子量： 329.16 ）。 此化合物分別處理於人類的肝癌細胞株 Hep G2 和 Hep 3B 48 小時其 IC50 分別為 9.903 μg/mL 和 6.388μg/mL 。 ◆肝癌 VS 牛樟芝二 教授 : 林俊清 研究生 : 郭育君 校院名稱 : 高雄醫學大學 研究對象及範圍 : 樟芝子實體乙酸乙酯層肝癌細胞株 HepG2 和 PLC/PRF/5 之活性與其作用機轉之探討 摘要 ： 樟芝 (Antrodia cinnamomea T.T. Chang & W.N. Chou) 為台灣特有種高價值的藥用真菌，又稱為牛樟芝或牛樟菇，僅生長於老齡牛樟樹，依其形態特徵被分類於薄孔菌屬 (Antrodia) 。有關樟芝之生物活性研究，根據文獻紀載其具有抗發炎、抗氧化、保肝等作用。在抗癌研究方面，則僅侷限於細胞毒殺的作用，對於癌細胞的增生抑制作用機制甚至其分子機轉的探討，都仍屬未知。因此本篇的研究主要是探討樟芝子實體乙酸乙酯層的萃取物 (EAC) 對肝癌細胞株 HepG2 與 PLC/PRF/5 誘發細胞凋亡 (apoptosis) 的作用機轉。在兩種細胞株中， EAC 可以顯著的抑制其細胞增生率，並呈現濃度從屬效應 (dose-dependent manner) 。藉由分析 DNA fragmentation 及 nucleosome ELISA 的方式進一步確認 EAC 是經由誘發細胞凋亡來抑制兩種不同的肝癌細胞株生長。在 HepG2 中， EAC 可以在不活化 p53 分子下，直接活化 Fas receptor 與 Fas ligand ，透過 death receptor 途徑誘發細胞凋亡。另外， EAC 在兩種細胞株中都可以透過 mitochondrial 途徑誘發細胞凋亡。另一方面， EAC 也會影響細胞存活的訊息傳導途徑，刺激細胞質中的 IκBα 活化，造成細胞核中 NF-κB 的量降低，活性也受到抑制。故本研究已詳細地探究樟芝子實體乙酸乙酯層的萃取物 (EAC) 誘發肝癌細胞凋亡 (apoptosis) 的分子機轉。 ◆中草藥對肝炎之研究探討 教授 : 黃惠宇 博士 研究生 : 盧曉鈴 校院名稱 : 實踐大學 研究對象及範圍 : 中草藥對肝炎之研究探討 摘要 ： 根據衛生署公佈之國人十大癌症死因疾病，顯見肝病已成為我國之國病，尤其以 B 肝及 C 肝為威脅國人健康之首，因此，提出新型治療方式，有效降低血清病毒量、使肝功能恢復正常並改善患者免疫功能，將會是治療肝病之重大突破。 本研究主要分為三個部分，第一部份是探討 樟 芝併用干安能是否具有加乘慢性 B 型肝炎的治療效果，實驗對象，來自台中沙鹿光田綜合醫院 B 型肝炎門診病患，並分為兩組： A 組給予干安能併用 樟 芝治療， B 組單獨給予干安能治療，分別於治療 3 個月及 6 個月時，分析患者之肝功能 (GPT) 、病毒量 (HBV DNA) 及免疫功能之變化。實驗結果顯示， A 組及 B 組治療 6 個月時，其 GPT 值都大幅下降至正常，其值分別為 25.91U/L 及 24.07U/L 。另外，治療 6 個月時， A 組有 50 % 的患者測不到 HBV DNA 的量， 41.6 % 的患者產生 e 抗原轉陰 ( 指 e 抗原消失且產生 e 抗體 ) ；而單獨服用干安能的 B 組，有 14.28 % 的患者測不到 HBV DNA 的量， 12.5 % 的患者產生 e 抗原轉陰。在免疫功能方面，合併 樟 芝治療的 A 組，治療 3 個月及 6 個月時，其毒殺型 T 細胞 (CD8) 及 B 細胞與控制組相比，分別上升了 19.05 % 、 14.11 % 及 13.04 % 、 11.85 % ，而且具有統計上意義。此外，治療 6 個月時，活化型 T 細胞 (HLA-DR) 與治療 3 個月時相比，減少了約 28.50 % ，並具統計上的明顯意義。結果顯示合併 樟 芝治療的 A 組，比單獨使用一般性治療的 B 組，出現有意義且明顯的改善，由此可推測得知，併用 樟 芝治療將會藉由提升 B 細胞及毒殺型 T 細胞之免疫反應，進而使 B 型肝炎患者減少 HBV DNA 病毒量， e 抗原轉陰率的比例亦提升。 第二部分是探討干擾素 / Ribavirin 併用冬蟲夏草是否具有加乘 C 型肝炎的治療效果，實驗對象，來自台中沙鹿光田綜合醫院 C 型肝炎門診病患，並分為兩組： A 組給予短效型干擾素合併抗病毒藥及冬蟲夏草治療， B 組給予長效型干擾素合併抗病毒藥治療，分析治療 3 個月及 6 個月時，患者之肝功能 (GPT) 、病毒量 (HCV RNA) 及免疫功能之變化。實驗結果顯示， A 組及 B 組治療 6 個月後，其 GPT 值都大幅下降至正常，其值分別為 23.35 U/L 及 22.32 U/L 。另外，治療 6 個月時， A 組有 92.8 % 的患者測不到 HCV RNA 的量；而給予長效型干擾素 α-2b/ribavirin 的 B 組，有 25 % 的患者測不到 HCV RNA 的量。在免疫功能方面，合併冬蟲夏草治療的 A 組，治療 3 個月及 6 個月時，其 T 細胞及輔助型 T 細胞 (CD4) 與控制組相比，分別上升了 2.29 % 、 2.73 % 及 7.64 % 、 8.73 % ，具有統計意義。此外，毒殺型 T 細胞 (CD8) 及活化型 T 細胞 (HLA-DR) ，治療 3 個月時與控制組相比，分別下降了 5.85 % 及 33.03 % ，具有統計意義。實驗結果顯示，合併冬蟲夏草治療的 A 組比單獨使用一般性治療的 B 組，出現有意義且明顯的改善，由此可推測得知，併用冬蟲夏草治療可能會藉由提升輔助型 T 細胞的功能，進而使 C 型肝炎患者減少 HCV RNA 病毒量。 第三部分是評估敗醬草抗病毒之能力，利用中國草藥－敗醬草 (Herba Patriniae) 處理可持續分泌出高量的 B 型肝炎表面抗原、 e 抗原及病毒顆粒體之 Hep-ES2 肝癌細胞株，實驗分別以酵素連結免疫吸附法 (ELISA) 、 DPPH 測定法及 MTT 分析法，測定 B 型肝炎表面抗原 (HBsAg) 、 e 抗原 (HBeAg) 、清除自由基能力及毒殺能力，藉以評估敗醬草抗病毒之能力。實驗結果顯示，給予 Hep-ES2 肝癌細胞株甲醇萃及水萃敗醬草處理 48 小時，在無細胞毒害的劑量 (noncytotoxic dose) 250 μg/mL 下，敗醬草甲醇萃取液與敗醬草水萃取液，對 B 型肝炎表面抗原及 e 核心抗原之抑制率相對於控制組 (0 %) 分別為 24 % 、 17 % 及 2 % 、 12 % 。而在清除 DPPH 自由基的能力方面，亦發現敗醬草甲醇萃取液大於敗醬草水萃取液，且隨著濃度的上升，其清除 DPPH 自由基的能力也會跟著上升。由以上結果可知，敗醬草具有對抗 B 型肝炎病毒能力，而且以敗醬草甲醇萃取液優於水萃取液，而敗醬草抗病毒能力與其清除 DPPH 自由基的能力並不是成正比的。 ◆樟芝菌絲體之培養及其多醣體抗乙型肝炎病毒活性評估 教授 : 謝明村 ; 盧美光 ; 謝文全 研究生 : 李一宏 校院名稱 : 中國醫藥學院 研究對象及範圍 : 樟芝菌絲體之培養及其多醣體抗乙型肝炎病毒活性評估 摘要 ： 樟芝只寄生在牛樟樹腐朽的樹幹內，樟芝是台灣民間經常應用的中草藥，含有三  類、胺基酸、蛋白質、糖類和多醣體。本研究包括： (1) 測量樟芝多糖體之單醣組成， (2) 不同含糖培養基對樟芝醣類化合物合成之影響， (3) 利用 high-performance anion-exchange Chromatography(HPAEC) 對於五種樟芝的多醣作定性分析， (4) 以 B 型肝炎病毒產生的 MS-G2 cell Line 研究五種樟芝多醣體對抗 B 型肝炎病毒的作用。 本研究的結論為： (1) 添加 40g/L 濃度的葡萄糖和半乳糖，樟芝生長速度均有明顯的增加，且最快速。添加 10-80g/L 濃度的鼠李糖、木糖、麥芽糖，對樟芝生長速度無明顯之影響。分析培養 60 天的樟芝菌絲體，添加葡萄糖可以增加阿拉伯糖和葡萄糖的量，添加蔗糖則提高木蜜醇的合成，添加鼠李糖可以提高鼠李糖在細胞中的合成，添加半乳糖可以提高肌醇和葡萄糖的量，木糖則降低葡萄糖和木蜜醇的合成。 (2) 樟芝子實體和培養的菌絲體之多糖體不同，分析培養 26 天的樟芝菌絲體，有中性糖，半乳糖，葡萄糖，甘露醇，半乳糖胺。 (3) 所有的樟芝菌絲多醣體均有抗 B 型肝炎抗毒的活性，其中 B86 在 50μg/ml 有強烈抑制 B 型肝炎病毒表面抗原的作用，而且比 1000 單位 /ml 的 α- 干擾素還有效，只有 B86 及 35398 兩種有對抗 B 型肝炎病毒核心抗原的活性，所有樟芝菌絲體均無細胞毒性。 本研究中，五種樟芝菌絲體中的 B86 表現出優良的抗 B 型肝炎作用，其生物效能及活體實驗，值得再繼續研究 ◆樟芝保肝 作用之探討 指導教授: 陳健祺 ; 林錫璋 研究生 : 李貞宜 校院名稱 : 南台科技大學 研究對象及範圍 : 樟芝保肝 作用之探討 [ 摘要 ] 菇類已經在全世界被廣泛的用來治療疾病有數千年的歷史。其中樟芝為台灣民間之傳統用藥，相信其有某種程度的治療效果，特別是保肝方面。因此本研究藉由MTT assay來評估樟芝萃取物對肝癌細胞（包括：Hep 3B, Hep G2及Alexander cells）生長的抑制效果；另外，以硫代乙醯胺（TAA）誘導大鼠肝纖維化或肝硬化模式作為評估樟芝是否有保肝效果，其功效以Masson trichrome的染色方法評估肝纖維化或肝硬化的程度。此外，也利用體外試驗的方式，以anti-HBsAg assay評估樟芝對anti-HBsAg 的效果。 結果顯示，樟芝水萃物或酒萃物對肝癌細胞Hep 3B, Hep G2及Alexander 細胞增生的抑制率分別為76、77 and 68 %。在動物實驗進行十二週後，TAA成功的誘導極嚴重的肝硬化產生，且在給予樟芝水萃物後能有效的降低肝損傷。此外，在anti-HBsAg assay中，樟芝萃取物也能有效的抑制Alexander cell 所分泌的HBsAg。 此研究結果證明，樟芝水萃物有保護肝臟之能力，此可提供作為在另類醫療中的參考。 ◆利用蛋白質體探討樟芝萃取物處理在人類肺癌細胞株 (A549) 教授 : 吳定峰 研究生 : 潘致良 校院名稱 : 南台科技大學 研究對象及範圍 : 利用蛋白質體探討樟芝萃取物處理在人類肺癌細胞株 (A549) [ 摘要 ] 樟芝又稱牛樟芝或牛樟菇，學名為 Antrodia camphorata ，是台灣特有一種真菌，僅生長於台灣特有之牛樟樹，生長緩慢、得之不易，故更顯其彌足珍貴。樟芝在台灣傳統醫藥歷史中始終被視為珍貴藥材，具有神奇的醫療保健功效。根據最近研究顯示，以 2 % (v/v) 固態發酵樟芝乙醇萃取液處理人類「肺癌」 A549 細胞株 72 小時，對 A549 細胞具有抑殺的效果。 在本實驗中，使用蛋白質體學技術來研究經固態發酵樟芝乙醇萃取液處理 8 小時的 A549 細胞和未經處理的 A549 細胞中表現量不同的蛋白質，利用 PDQUEST 軟體比對經處理及未經處理 A549 細胞的二維電泳圖譜，以找出表現差異 2 倍或 2 倍以上的蛋白質，在本論文中我們找到 5 個顯示統計上 2 倍或 2 倍以上顯著表現差異的蛋白質點（ P